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Juliette Bardel-Lavaux

La mitochondrie végétale, étude protéomique et caractérisation des premières étapes de la voie de biosynthèse des acides gras et du lipoate



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Publié le 12 septembre 2003


Thèse soutenue le 12 septembre 2003 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Biologie

Résumé :
En dépit de nombreuses études réalisées sur la mitochondrie végétale, siège de nombreuses biosynthèses, il subsiste sans aucun doute des fonctions mitochondriales à découvrir. Dans la première partie du travail, nous avons entrepris une étude protéomique sur les mitochondries purifiées à partir de différents tissus (feuilles chlorophylliennes, feuilles étiolées, racines et graines) de la plante de pois. Une identification systématique des protéines solubles majeures a été réalisée puis une étude comparative des protéomes a mis en évidence des protéines mitochondriales qui s'expriment de manière spécifique dans certains tissus de la plante. L'étude du protéome soluble mitochondrial des feuilles chlorophylliennes a permis d'établir une carte de référence de 433 spots (correspondant à environ 73% des protéines détectées en masse) où 78 spots ont été analysés par les trois approches : dégradation Edman, Matrix Adsorption Laser Desorption Ionization-Time Of Flight (MALDI-TOF) et Electrospray Ionization-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (ESI-MS/MS). Une combinaison d'électrophorèse 2D avec la chromatographie sur gel filtration comme troisième dimension a permis d'identifier les protéines majeures et d'obtenir des informations supplémentaires sur le statut oligomérique des protéines ainsi que sur les interactions protéine-protéine. Une série de protéines attendues sont celles de la voie photorespiratoire (GDC et SHMT) qui représentent 37% de la totalité des protéines. Par ailleurs, la proéminence des aldéhydes déshydrogénases (ALDH, 7,5%) dans les tissus foliaires suggère une fonction antioxydante pour les aldéhydes. Cette méthodologie a également conduit à l'identification de 45 protéines issues de mitochondries purifiées à partir des feuilles étiolées, graines et racines de pois. Notre travail a montré pour la première fois la présence de certaines protéines dans la mitochondrie végétale comme la formate déshydrogénase en tant que protéine majeure dans les graines de pois, les petites chaperonnes HSP 22 ou encore les protéines de maturation de graine (LEA).
Dans la seconde partie de la thèse, une étude biochimique concernant les premières étapes de la voie de biosynthèse des acides gras et de l'acide lipoïque se déroulant dans la mitochondrie végétale, a été entreprise afin de caractériser certaines enzymes impliquées dans l'étape activant le malonate en malonyl-ACP. En combinant la spectrométrie de masse MALDI-TOF et les mesures de marquage, nous avons pu caractériser et purifier l'équipement enzymatique qui permet d'activer le malonate en malonyl-ACP et en acétyl-ACP, les deux précurseurs indispensables à l'initiation de l'élongation des acides gras. Cette activation peut emprunter au moins deux chemins métaboliques : l'un catalysé par la malonyl-ACP synthétase (MAS) et l'autre par la malonyl-CoA synthétase (MCS) couplée à la malonyl-CoA : ACP transacylase (MCAT). La purification des enzymes MAS et MCS devrait être poursuivie afin de préciser leur mécanisme réactionnel au niveau moléculaire. Chez le pois, nous avons mis en évidence deux activités MCAT : chloroplastique et mitochondriale. Comme il existe un seul gène putatif codant pour la MCAT chez Arabidopsis, nous avons démarré des expériences de GFP (Green Fluorescent Protein) afin de préciser la relation entre la localisation subcellulaire et l'existence probable d'au moins de deux isoformes.

Jury :
Président : Pr Roland Douce
Rapporteur : Pr David Macherel
Rapporteur : Dr Jean-François Morot-Gaudry
Examinateur : Pr Michel Herzog
Directeur de thèse : Dr Jacques Bourguignon

Mots-clés :
Mitochondrie végétale, Protéomique, Différenciation tissulaire, Biosynthèse des acides gras mitochondriaux, Malonate, ACP, CoA, Spectrométrie de masse

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