Thèse soutenue le 16 décembre 2003 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Biologie
Résumé :
La biotine (vitamine H ou B8) est synthétisée exclusivement par les plantes et les microorganismes. Dans les cellules végétales, la dernière étape de la voie de biosynthèse de cette vitamine est catalysée par la biotine synthase. Préalablement à cette étude, un ADNc de
Arabidopsis thaliana, appelé
bio2, avait été caractérisé au laboratoire et la protéine correspondante sur-exprimée dans les cellules d’E. coli, puis purifiée. Cependant, aucune activité biotine synthase n’avait pu être associée à cette protéine, si bien que le mécanisme réactionnel de l’enzyme de plante était inconnu.
Le développement de tests biochimiques sensibles et l’utilisation de bactéries sur-exprimant le produit du gène
bio2 d’A. thaliana ont permis, pour la première fois, de détecter et de quantifier précisément une activité biotine synthase de plante. Dans un milieu réactionnel optimisé, le turnover de la réaction est >2h-1, indiquant que l’enzyme de plante n’est pas, comme cela a été proposé pour l’enzyme bactérienne, un substrat réactionnel. La purification de la protéine recombinante d’A. thaliana indique que Bio2, comme son homologue bactérien, est active sous la forme d’un complexe multi-enzymatique. Dans un système plante reconstitué
in vitro, seules les fractions mitochondriales (préparées à partir de feuilles de pois et de tubercules de pomme de terre) restaurent efficacement l’activité biotine synthase associée à la protéine Bio2 purifiée. Un criblage biochimique de la matrice mitochondriale de pomme de terre (fractionnement et reconstitution
in vitro de l’activité biotine synthase) et l’analyse des banques de données de
Arabidopsis thaliana ont permis d’identifier une adrénodoxine (Adx), une adrénodoxine réductase (AdxR) et une cystéine désulfurase (Nfs1) comme les protéines essentielles à la réaction biotine synthase de plante. Les différents ADNc d’A. thaliana codant chacune de ces protéines ont été clonés dans des vecteurs d’expression, et les protéines correspondantes surproduites dans les cellules d’E. coli. La stimulation de l’activité biotine synthase
in vitro par la protéine Nfs1 indique que la cystéine est le donneur de soufre initial pour la biotine dans les mitochondries végétales. La purification de l’Adx1 et de l’AdxR d’A. thaliana a permis d’établir la première caractérisation biochimique d’une réaction Adx/AdxR chez les végétaux supérieurs. Ces deux protéines forment une chaîne de transfert d’électrons à bas potentiel dont l’interaction avec Bio2 est indispensable à l’activité biotine synthase. Ainsi, le produit du gène
bio2 d’A. thaliana est le premier partenaire protéique identifié chez les plantes supérieures du système redox Adx/AdxR mitochondrial. Le transfert des électrons entre les différents acteurs moléculaires du complexe biotine synthase de plante nécessite des interactions protéine-protéine, dont une analyse préliminaire a été réalisée. Parallèlement à cela, nous avons initié une étude structurale du produit du gène
bio2 d’A. thaliana afin de compléter la caractérisation fonctionnelle de la réaction biotine synthase dans les cellules végétales.
En conclusion, la caractérisation biochimique de la réaction biotine synthase d’A. thaliana démontre l’importance de la mitochondrie végétale dans la biosynthèse de la biotine. De plus, l’identification et la participation du système redox Adx/AdxR matriciel dans la synthèse de cette vitamine ouvrent de nouvelles perspectives de compréhension de la régulation de l’activité biotine synthase dans les cellules végétales.
Jury :
Président : Marc Fontecave
Rapporteur : Jean-François Briat
Rapporteur : D. Florentin
Examinateur : Claude Alban
Examinateur : Roland Douce
Directeur de thèse : Claude Alban
Mots-clés :
Biotine synthase,
Arabidopsis thaliana, Mitochondrie, Adrénodoxine, Adrénodoxine réductase, Cystéine désulfurase, Centres Fe-S, Interactions protéine-protéine