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Benoît Van der Rest

Le métabolisme de la glycérophosphocholine chez les végétaux : caractérisation d'une glycérophosphodiester phosphodiestérase



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Publié le 1 février 2002


Thèse soutenue le 1er février 2002 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Biologie

Résumé :
La GPC, généralement présente en très faible concentration dans les cellules végétales, peut s'accumuler au cours de processus physiologiques impliquant des remaniements membranaires (carences carbonées, germination, basses températures). Le devenir de cette molécule, qui constitue l'extrémité polaire de la phosphatidylcholine, était méconnu chez les cellules végétales.
Des expériences de résonance magnétique nucléaire du 31P réalisées sur des cellules de carotte incubées en présence de GPC ont révélé l'existence d'une GPC-phosphodiestérase (GPC-PDE) à la surface des cellules. Cette enzyme clive la GPC en choline et sn-glycérol 3-phosphate, ce dernier étant hydrolysé en phosphate et glycérol par les phosphatases acides de la paroi. La choline et le phosphate sont ensuite incorporés dans la cellule par des transporteurs spécifiques tandis que le glycérol pénètre par diffusion libre ou facilitée. Les trois composés sont métabolisés par la cellule ultérieurement. La GPC-PDE extracellulaire a été localisée dans la paroi des cellules. Par ailleurs, nous avons isolé du suc vacuolaire une deuxième GPC-PDE. Ces deux GPC-PDE sont induites en carence de phosphate.
La protéine responsable de cette activité est inédite chez les végétaux. À partir de parois de cellules de carotte, la protéine a été purifiée et enrichie d'un facteur 2700, ce qui a révélé l'existence d'un polypeptide de 55 kDa co-purifié avec l'activité GPC-PDE. Il s'agit d'une glycoprotéine ayant une forte affinité pour la GPC (Km de 36µM), mais capable également d'hydrolyser d'autres glycérophosphodiesters comme la glycérophosphoéthanolamine, le glycérophosphoinositol, la glycérophosphosérine et le glycérophosphoglycérol.
Afin de caractériser plus précisément cette protéine, nous avons développé une approche de biologie moléculaire basée sur la recherche d'homologues végétaux d'une phosphodiestérase bactérienne (GLPQ) dont les propriétés s'apparentent à celles de la GPC-PDE de cellules de carotte. À partir d'une EST d'Arabidopsis, nous avons cloné l'ADNc codant l'homologue végétal de la phosphodiestérase GLPQ. L'expression de l'ADNc dans un vecteur bactérien a produit la protéine recombinante en grande quantité. Malheureusement, celle-ci est apparue sous forme de corps d'inclusion, demeurant ainsi inactive. En revanche, les anticorps dirigés contre la protéine recombinante d'Arabidopsis reconnaissent spécifiquement la protéine de 55 kDa. Le séquençage interne de la protéine de 55 kDa et la très forte corrélation entre l'activité GPC-PDE et le marquage montrent que la protéine de 55 kDa, homologue des phosphodiestérases bactériennes, est effectivement responsable de l'hydrolyse de la GPC chez les cellules végétales.

Jury :
Rapporteur : Jean-Claude Kader
Rapporteur : Alain Pugin
Examinateur : Alain Boudet
Examinateur : Roland Douce
Directeur de thèse : Richard Bligny

Mots-clés :
Turnover de la tête polaire des phospholipides, glycérophosphocholine, phosphodiestérase, résonance magnétique nucléaire, cellules de carotte, paroi, vacuole

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