Thèse soutenue le 22 février 2000 pour obtenir le grade de Docteur de l'École Nationale Supérieure Agronomique de Rennes - Discipline : Biologie
Résumé :
La protéine H du complexe mitochondrial de la glycine décarboxylase (GDC) est une protéine à lipoate qui joue un rôle central dans la décarboxylation oxydative de la glycine. Au cours du mécanisme réactionnel de la GDC, elle interagit successivement avec les trois autres protéines du complexe P, T et L par l’intermédiaire de son bras lipoate fixé de façon covalente à un résidu lysine spécifique. Lors de la décarboxylation de la glycine par la protéine P, le groupement méthylamine qui en résulte est fixé sur le lipoate qui se replie alors dans une cavité hydrophobe au sein de la protéine H. Par mutagénèse dirigée des résidus E14, I27 et S12 de la cavité, nous avons réalisé l’étude des interactions susceptibles de stabiliser le groupement méthylamine dans la cavité. Les protéines H mutantes et la protéine H sauvage ont été analysées par différentes techniques biophysiques puis caractérisées biochimiquement dans la GDC en étudiant la réaction globale et les réactions partielles. Les analyses structurales ont montré qu’une simple mutation pouvait amener à une déstructuration de la protéine H. L’étude fonctionnelle de la protéine mutante structurée HE14A a mis en évidence le rôle crucial des interactions du résidu E14 avec le groupement NH3+ de la méthylamine et le carboxyle du résidu S12 dans la stabilisation de la forme chargée en méthylamine. Par ailleurs, les analogies structurales et fonctionnelles des protéines à lipoate et des protéines à biotine nous ont amené à construire un double mutant dans lequel le motif de lipoylation VKA a été remplacé par le motif de biotinylation MKM. Nous avons ainsi montré que les résidus encadrant la lysine, site de fixation du lipoate, n’intervenaient pas dans le mécanisme de lipoylation mais étaient essentiels dans les interactions entre les protéines P et H.
Dans une deuxième partie, nous avons mis en évidence la synthèse du lipoate dans la mitochondrie végétale. La voie empruntée serait analogue à celle du système FAS II des bactéries et des chloroplates conduisant aux acyls-ACP de 4 à 18 carbones, les acyls-ACP à 8, 16 et 18 carbones étant majoritaires. Le malonate est, contrairement à l'acétate, le précurseur de la synthèse du lipoate et des acides gras à longue chaîne synthétisés dans la matrice mitochondriale. Une dizaine d'enzymes indépendantes interviendraient afin d’assurer l’élongation des acyls-ACP. Nous avons commencé la caractérisation biochimique des enzymes initiant la voie de biosynthèse et utilisant le malonate. Les paramètres cinétiques de la malonyl-CoA synthétase (MCS), qui permet d’activer le malonate en malonyl-CoA, ont été déterminés. Deux autres activités enzymatiques ont été mises en évidence, la malonyl-CoA:ACP transacylase (MC:AT), qui convertit rapidement le malonyl-CoA en malonyl-ACP, et la malonyl-ACP synthétase (MAS), qui permet la synthèse de malonyl-ACP directement à partir de malonate. L’élongation de l’unité malonyl-ACP ainsi formée est assurée par des enzymes de condensation conduisant à deux acyls-ACP principaux, l’octanoyl-ACP et l’hexadécanoyl-ACP. Le premier doit être destiné à la synthèse de lipoate grâce à l’insertion de deux atomes de soufre par un donneur inconnu et le second conduirait aux acides gras membranaires à longue chaîne. Nous avons montré que l’apoprotéine H pouvait être octanoylée et lipoylée par un extrait matriciel à partir de malonate. Ainsi, la matrice possède tout l’équipement enzymatique nécessaire à la modification posttraductionnelle de l’apoprotéine H, de la synthèse du groupement lipoate à partir de malonate jusqu’à sa fixation par une enzyme lipoyl ligase.
Jury :
Président : Pr Philippe Legrand
Rapporteur : Pr François Larher
Rapporteur : Pr Claude Cassagne
Examinateur : Pr Roland Douce
Examinateur et directeur de thèse : Dr Jacques Bourguignon
Mots-clés :
Protéine H, Complexe mitochondrial de la glycine décarboxylase, GDC, lipoate, apoprotéine H