Jean-Marie Mouillon
Étude du métabolisme du folate chez les plantes. Caractérisation de la 6-hydroxyméthyl-7,8-dihydroptérine pyrophosphokinase/7,8-dihydroptéroate synthase
Publié le 27 janvier 2000
Corps de texte 1
Thèse soutenue le 27 janvier 2000 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Biologie
Résumé :
L'acide folique (vitamine B9) est un cofacteur indispensable au transport des groupements monocarbonés (métabolisme C1). Il intervient en particulier dans la synthèse des acides nucléiques et joue un rôle important dans le métabolisme de certains acides aminés (glycine, sérine et méthionine). Les plantes, les bactéries et certains protozoaires, contrairement aux animaux, sont capables de synthétiser
de novo le folate. La voie métabolique conduisant à la synthèse du folate à partir de la 6-hydroxyméthyl-7,8-dihydroptérine comporte cinq étapes enzymatiques. Toutes ces étapes sont présentes dans les mitochondries de feuilles de pois. Nous avons montré que les deux premières, catalysées par la 6-hydroxyméthyl-7,8-dihydroptérine pyrophosphokinase (HPPK) et la 7,8-dihydroptéroate synthase (DHPS), sont portées par une seule enzyme bifonctionnelle, exclusivement localisée dans la mitochondrie. Cette protéine a été purifiée à partir de mitochondries de feuilles de pois et elle apparaît comme une protéine mineure de la matrice mitochondriale.
Nous avons isolé et analysé un ADNc codant pour la protéine HPPK-DHPS par criblage d'une banque d'ADNc de feuilles de pois. La séquence primaire de la protéine HPPK-DHPS a ainsi pu être déterminée et révèle la présence d'une séquence d'adressage de type mitochondriale à l'extrémité N-terminale. La séquence primaire de la protéine HPPK-DHPS présente de grande similarité avec les protéines monofonctionnelles HPPK et DHPS bactériennes.
Afin de mieux caractériser le mécanisme enzymatique de cette protéine bifonctionnelle, nous avons choisi d'obtenir une plus grande quantité de protéine en produisant la protéine mature HPPK-DHPS de plante dans un système procaryote. Nous avons réussi a obtenir la protéine HPPK-DHPS recombinante en faible quantité mais présentant des propriétés catalytiques comparables à celles observées pour la protéine mature. Les études des propriétés biochimiques de l'activité DHPS ont montrées que cette réaction est finement régulée par le produit de la réaction, c'est à dire le 7,8-dihydroptéroate, et les autres intermédiaires de la voie de synthèse du folate comme le dihydrofolate et le tétrahydrofolate. De plus, l'activité DHPS est fortement inhibée par les sulfamides, comme l'enzyme bactérienne, et ces composés sont donc aussi des herbicides potentiels. L'étude des propriétés biochimiques de l'activité HPPK a également permis de mettre en évidence un mode de fixation séquentiel ordonné des substrats. Cette activité, fortement couplée à l'activité DHPS, est régulée par les substrats de cette dernière.
Parallèlement, nous avons étudié sur des cultures cellulaires d'Erable, quels sont les différents donneurs d'unités monocarbonées transportées par le folate. Ces études ont été réalisées par Résonance Magnétique Nucléaire en utilisant des produits marqués
13C. Les résultats obtenus mettent en évidence la présence du complexe de la glycine décarboxylase (GDC) au sein de ces cellules non-photosynthétiques. Le catabolisme de la sérine initié par l'activité sérine hydroxyméthyl transférase (SHMT) cytosolique constitue la principale source d'unités monocarbonées. La glycine formée par cette activité est recyclée dans la mitochondrie par le couplage des activités GDC et SHMT mitochondriales pour former une molécule de sérine à partir de deux molécules de glycine. Il se forme ainsi un véritable cycle "glycine-sérine", conduisant, à la formation d'une molécule de CO2, une molécule de NH3 et de 2 molécules de 5,10-méthylène-tétrahydrofolate à partir d'une sérine.
Jury :
Président : Roland Douce
Rapporteur : Alain Pugin
Rapporteur : Jean-François Morot-Gaudry
Examinateur : Per Gardeström
Examinateur : Fabrice Rébeillé
Directeur de thèse : Fabrice Rébeillé
Mots-clés :Mitochondries des plantes, Métabolisme C1, Synthèse du folate, Dihydroptéroate synthase, Catabolisme des acides aminés glycine et sérine
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