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Sylvain Boutigny

Quelques observations sur le rôle des ATPases à cuivre, HMA1 et PAA1, dans le contrôle de l'homéostasie du cuivre chloroplastique



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Publié le 28 octobre 2009


Thèse soutenue le 28 octobre 2009 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Biologie végétale

Résumé :
Le chloroplaste est un organite spécifique de la cellule végétale. Il est délimité par une double membrane ou enveloppe qui renferme de nombreux systèmes de transports d'ions et de métabolites essentiels au fonctionnement du chloroplaste et de la cellule végétale. A ce jour, seuls quelques transporteurs de métaux associés à l’enveloppe des plastes ont été identifiés : un transporteur de fer, un transporteur de magnésium ainsi que deux ATPases à cuivre de type P1B : HMA1 et PAA1. PAA1 représenterait la voie principale d'import du cuivre dans le chloroplaste, notamment pour alimenter la photosynthèse. HMA1 constituerait une voie additionnelle d’import du cuivre, voie essentielle pour répondre à un stress oxydatif qui apparaît en particulier lorsque la plante est cultivée en lumière forte. Afin de mieux comprendre les rôles respectifs de ces deux ATPases dans la régulation de l'homéostasie du cuivre chloroplastique, deux approches complémentaires ont été développées :
- une approche in planta visant à produire de nouvelles lignées affectées dans l’expression de l’une (mutant paa1 surexprimant HMA1) ou de ces deux ATPases (double mutant hma1/paa1), puis à identifier des conditions (stress lumineux, stress salin, excès de métaux) révélant le rôle essentiel de ces ATPases ou induisant une réponse transcriptionnelle différente des gènes codant ces ATPases ou d’autres acteurs liés à l’homéostasie du cuivre... Les résultats obtenus montrent que la fonction de HMA1, connue pour être essentielle lors d'un stress lumineux, est aussi requise lorsque la plante subit un stress salin. Ces résultats confortent le rôle de HMA1 dans la délivrance du cuivre à la superoxyde dismutase (cuivre/zinc) du chloroplaste. D'autre part, nous avons montré qu’en condition de culture photoautotrophe, le cuivre permet de supprimer partiellement la photosensibilité du mutant hma1, validant ainsi l'implication de HMA1 dans l'homéostasie du cuivre. Nous avons aussi démontré que les fonctions de HMA1 et PAA1 ne sont pas redondantes. Le cuivre importé par ces deux ATPases est probablement délivré à des protéines cibles par des voies différentes. Enfin, nous avons montré qu’il existe une troisième voie d’import de cuivre dans le chloroplaste, voie encore non caractérisée.
- une approche in vitro visant à produire ces deux ATPases​ HMA1 et PAA1 dans le système hétérologue Lactococcus lactis afin de déterminer leurs spécificités ioniques et leurs caractéristiques biochimiques. Le système d'expression procaryote L. lactis a été mis en place au laboratoire et s’avère parfaitement adapté à la production de protéines membranaires de plantes. Ce système a permis de produire plusieurs protéines membranaires d’Arabidopsis, dont HMA1 et PAA1, en quantités compatibles avec des analyses biochimiques. Nous avons déterminé les conditions de solubilisation et de purification de ces deux protéines. Nous n'avons pas pu mesurer d'activité ATPase associée à ces protéines. En revanche, nos données indiquent que ces deux protéines recombinantes peuvent lier l’un de leur substrat ; l’ATP. Nous avons aussi pu démontrer que PAA1 peut lier du cuivre sous forme 1+ et sous forme 2+.
Au bilan, ces données suggèrent que le contrôle de l'homéostasie du cuivre chloroplastique requiert plusieurs systèmes de transport indépendants et une régulation fine de ces voies d'import de cuivre afin d’alimenter les besoins liés à la photosynthèse et les besoins liés aux mécanismes de résistance aux stress oxydatifs.

Jury :
Président : Eva Pebay-Peyroula
Rapporteur : Michel Lebrun
Rapporteur : Alain Vavasseur
Examinateur : Patrice Catty
Examinateur : Daphné Seigneurin-Berny
Examinateur : Norbert Rolland
Directeur de thèse : Norbert Rolland
Co-directeur de thèse : Daphné Seigneurin-Berny

Mots-clés :
Chloroplaste, enveloppe, protéine membranaire, ATPase de type P, cuivre, Arabidopsis thaliana, Lactococcus lactis

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