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Olivier Zink

Identification de l'HPP oxydase d'Arthrobacter globiformis et de la 4-HPA 1-hydroxylase de Pseudomonas acidovorans. Étude du métabolisme de la tyrosine par des cellules végétales en utilisant la 13C-RMN



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Publié le 30 octobre 2000
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Thèse soutenue le 30 octobre 2000 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Biologie

Résumé :
Pour obtenir des plantes résistantes aux inhibiteurs de l'HPPD, nous souhaitons construire une voie métabolique contournant l'HPPD en introduisant les gènes codant les activités enzymatiques HPP oxydase et 4-HPA 1-hydroxylase. Nous décrivons ici l'identification de trois gènes bactériens codant ces deux activités enzymatiques. Le premier gène, hppO, code l'HPP oxydase (E.C. 1.2.3.-) qui catalyse l'oxydation de l'HPP en 4-HPA. C'est la première fois que la protéine est purifiée et le gène identifié. L'HPPO présente des homologies avec les ALS mais ne possède pas leur activité enzymatique. Le deuxième gène, hpaH, code une NADH,H+ oxydase dépendante du 4-HPA (HPAH). Cette flavoprotéine transforme le 4-HPA en un métabolite non encore identifié. Le troisième gène, hpaC, code la protéine HPAC qui catalyse la conversion du métabolite inconnu en homogentisate. La combinaison de l'HPAH et de l'HPAC produit l'activité enzymatique 4-HPA 1-hydroxylase (E.C. 1.14.13.18), ce qui semble être une troisième stratégie pour l'hydroxylation de composés aromatiques. Enfin, nous avons acquis des informations sur le métabolisme de la tyrosine par des cellules végétales en utilisant la RMN du carbone-13. Nous avons identifié un transporteur à tyrosine localisé sur le plasmalemme des cellules d'Acer en culture. C'est la première fois qu'un transporteur de haute affinité (15  µM ; pH  6,2) présente un pH optimum alcalin (pH  7,0 à 7,8). Nous avons aussi démontré que la tyrosine s'accumule dans la vacuole, après une phase de latence. Le métabolisme de la tyrosine est étudié dans les cellules d'Acer et d'Arabidopsis. Le 4-HPA est identifié comme provenant de la tyrosine seulement dans les cellules d'Arabidopsis. La prochaine étape est l'introduction des trois gènes dans une plante et l'analyse du métabolisme de la plante ainsi obtenue.

Mots-clés :
hppO, hpaH, hpaC, 4-hydroxyphénylacétate, homogentisate, 4-hydroxyphénylpyruvate, Arthrobacter, Pseudomonas, Acer, Arabidopsis, 13C-RMN, tyrosine, métabolisme, transporteur, localisation, flavoprotéine

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