Daphné Seigneurin-Berny
Recherche de nouveaux systèmes de transport à travers l'enveloppe du chloroplaste. Caractérisation de nouvelles protéines hydrophobes
Publié le 13 janvier 2000
Corps de texte 1
Thèses soutenue le 13 janvier 2000 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Discipline : Biologie
Résumé :
Le chloroplaste est un organite totalement intégré dans le métabolisme de la cellule végétale. Il possède des voies métaboliques qui lui sont propres comme la photosynthèse, la synthèse d'acides gras, la synthèse d'acides aminés. Le chloroplaste est limité par l'enveloppe, constituée de deux membranes distinctes et d'un espace intermembranaire. Par sa localisation, l'enveloppe du chloroplaste constitue un site privilégié de transport de métabolites, d'ions, de protéines et d'informations entre le stroma du chloroplaste et le cytosol de la cellule végétale. Ainsi, l'enveloppe doit renfermer de nombreux systèmes de transport permettant ces échanges. Malgré l'importance de ces transporteurs, très peu d'entre eux ont été totalement caractérisés. La limitation principale provient de la très faible représentation de ces protéines et de leur hydrophobicité. Afin de caractériser de nouveaux systèmes de transport, nous avons développé une nouvelle approche qui nous a permis d'identifier de nouvelles protéines. Nous avons ensuite poursuivi la caractérisation fonctionnelle de ces protéines.
L'approche que nous avons développée repose sur le caractère hydrophobe des transporteurs qui permet de les solubiliser dans des mélanges de solvants organiques, comme le chloroforme/méthanol. Cette approche permet l'extraction de protéines hydrophobes et mineures de l'enveloppe, elle est spécifique de la localisation subcellulaire. D'autre part, suivant leur hydrophobicité, les protéines peuvent être extraites de façon différentielle en fonction des rapports de solvants organiques. Les protéines extraites sont séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes, et analysées par microséquençage. Plusieurs protéines ont été identifiées dont les protéines IE16 et IE18.
Nous avons poursuivi la caractérisation fonctionnelle de IE16 et IE18 en analysant d'une part les homologies de séquences avec des protéines de fonction connue. D'autre part, nous avons obtenu des mutants de cyanobactéries et d'Arabidopsis thaliana dont les gènes correspondant aux protéines IE16 et IE18 ont été interrompus. L'analyse des phénotypes peut fournir des informations sur la fonction des protéines mutées. Notamment, la protéine IE18 pourrait être impliquée dans le transport des ions K+ et/ou H+. Afin d'effectuer des analyses biochimiques sur ces protéines, elles ont été exprimées dans des systèmes hétérologues. Ces protéines sont produites dans le système d'expression cellules d'insecte/baculovirus alors qu'aucune expression n'est détectée dans le système
E. coli. Ces protéines forment des homodimères. Les analyses fonctionnelles par électrophysiologie sont en cours actuellement.
Lors des premiers séquençages des protéines extraites dans les solvants organiques, une séquence correspondant à une annexine a été obtenue. Nous avons poursuivi l'étude de cette protéine. Le sulfolipide, lipide spécifique du plaste, est un site à haute affinité permettant l'interaction de l'annexine avec l'enveloppe. L'annexine copurifie avec les chloroplastes et des vésicules d'enveloppe en présence de calcium. Cette protéine ne forme pas de canal ionique lorsqu'elle est insérée dans des bicouches lipidiques planes. Elle ne présente pas non plus d'activité péroxydase. La signification de son interaction avec l'enveloppe du chloroplaste reste à être déterminée.
L'approche que nous avons développée peut être utilisée de façon systématique pour l'étude des transports dans différents systèmes membranaires.
Jury :
Président : Roland Douce
Rapporteur : Michel Lebrun
Rapporteur : Jean-Charles Sanchez
Examinateur : Hélène Barbier-Brygoo
Examinateur : Jacques Joyard
Examinateur : Norbert Rolland
Directeur de thèse : Jacques Joyard
Co-directeur de thèse : Norbert Rolland
Mots-clés :Enveloppe, Chloroplaste, Transport, Hydrophobicité, Solvants organiques, Génétique inverse, Expression fonctionnelle, Annexine, Sulfolipide
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